Gli scienziati quando hanno avuto bisogno di visualizzare la struttura della proteina spike, che i coronavirus usano per infiltrarsi nelle cellule umane, si sono rivolti alla microscopia crioelettronica (crio-EM), è uno degli strumenti di imaging più potenti nell’arsenale di un ricercatore, può visualizzare proteine, agenti patogeni e vari componenti cellulari quasi fino ai loro singoli atomi, ma la preparazione dei campioni per il crio-EM è un processo ingombrante che si basa sull’etano, un potente refrigerante in forma liquida e un gas infiammabile a temperatura ambiente soggetto a esplosioni.
Il nuovo studio pubblicato nella rivista International Union of Crystallography Journal dimostra che i campioni crio-EM possono essere preparati con un refrigerante più sicuro e meno costoso, l’azoto liquido, questi campioni possono produrre immagini ancora più nitide rispetto a quelli preparati con etano. I risultati capovolgono la saggezza convenzionale risalente agli anni ’80 e possono migliorare la sicurezza e la qualità della microscopia crioelettronica (crio-EM).
Robert Thorne, professore di fisica presso il College of Arts and Sciences e Weiss Presidential Fellow, ha detto:
«L’etano non è una sostanza chimica standard di laboratorio. È pericoloso e il suo utilizzo aggiunge ulteriori complicazioni. L’azoto liquido è il refrigerante preferito».
La microscopia crioelettronica (crio-EM), funziona bombardando elettroni attraverso molecole che vengono congelate rapidamente in uno strato d’acqua vetroso; catturando più immagini sfocate delle molecole all’interno del ghiaccio, i software gestiti dagli algoritmi sono capaci di ripulire il segnale dal rumore di fondo e restituire un’immagine 3D nitida, ma non in modo coerente.
È noto che parte della sfocatura deriva dal campione stesso, quando l’acqua che racchiude le molecole si raffredda troppo lentamente, forma cristalli di ghiaccio che degradano l’immagine. Gli scienziati aggirano questo problema utilizzando l’etano per raffreddare l’acqua così rapidamente da farla modificare in un foglio vetroso e privo di cristalli, ma un congelamento così rapido mette sotto stress il foglio vetroso, che poggia su una sottile pellicola d’oro. Il raggio di elettroni quando colpisce il foglio vetroso, lo stress fa muovere le molecole, sfocando l’immagine finale in un fenomeno noto come movimento indotto dal raggio.
Robert Thorne ha detto:
«Abbiamo due fattori opposti, vogliamo raffreddare i campioni velocemente, per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio e catturare la struttura biologica delle molecole, ma vogliamo anche raffreddare i campioni il più lentamente possibile per ridurre al minimo il loro movimento durante l’imaging. L’etano raffredda i campioni molto rapidamente, ma i ricercatori devono usare l’azoto liquido per convertire il gas etano in un liquido e poi più azoto liquido per conservare i campioni dopo che sono stati congelati. L’etano è ingombrante, è pericoloso e, alla fine, i campioni finiscono comunque nell’azoto liquido».
I rapporti degli ultimi 40 anni riportano che l’azoto liquido si raffredda a velocità di circa 50 volte più lente di quelle dell’etano, e non è abbastanza veloce da convertire l’acqua in una lastra vetrosa, ma nel 2006, il gruppo di ricerca di Robert Thorne ha scoperto che il principale fattore che rallentava l’azoto era il gas freddo che si librava sopra la superficie del liquido, che raffreddava piccoli campioni prima che arrivassero al liquido.
MiTeGen la società di Robert Thorne, alla fine sviluppò uno strumento di raffreddamento automatizzato per la cristallografia a raggi X (un altro metodo utilizzato per l’immagine delle molecole proteiche, rimuove il gas freddo appena prima che un campione venga immerso nell’azoto), scoprì che le velocità di raffreddamento aumentavano fino a sei volte più lento dell’etano. Il personale di MiTeGen ha quindi adattato il proprio strumento di raffreddamento per i campioni crio-EM e ha collaborato con il personale del Cornell Center for Materials Research e il socio Jonathan Clinger per raccogliere e analizzare i dati crio-EM.
Il nuovo studio riporta che l’azoto si raffredda alla velocità perfetta per la preparazione del campione crio-EM, abbastanza veloce da evitare una significativa formazione di cristalli di ghiaccio, ma abbastanza lento da ridurre in seguito il movimento indotto dal raggio.
Robert Thorne in conclusione ha detto:
«L’etano è eccessivo per la velocità di cui non hai bisogno, ottieni immagini sfocate con il movimento indotto dal raggio, e questo è più problematico che qualsiasi cristallo di ghiaccio che si forma da un raffreddamento leggermente più lento. Il raffreddamento all’azoto liquido, semplificherà i flussi di lavoro crio-EM, rimuovendo i passaggi aggiuntivi richiesti dall’etano, rendendo più semplice la progettazione di strumenti di raffreddamento automatizzati che soddisfino gli attuali standard di sicurezza di laboratorio».