Immagina di tamponarti le narici, inserire il tampone in un dispositivo e ottenere in 15-30 minuti una lettura sul tuo cellulare che può dirti se sei infetto dal coronavirus Covid-19. È stata questa la visione per un team di scienziati presso Gladstone Institutes, University of California, Berkeley (UC Berkeley) e University of California, San Francisco (UCSF). Ora, riferiscono di una svolta scientifica che li avvicina a trasformare questa visione in realtà.
La disponibilità di test rapidi di massa è uno dei principali ostacoli alla lotta contro la pandemia coronavirus Covid-19 e alla completa riapertura delle attività in tutto il paese. Sapere chi è infetto fornirebbe preziose informazioni sulla potenziale diffusione e minaccia del virus sia per i governanti sia per i cittadini.
Le persone spesso devono aspettare diversi giorni per i loro risultati, o anche di più quando c’è un lavoro arretrato nell’elaborazione dei test di laboratorio. E la situazione è aggravata dal fatto che la maggior parte delle persone infette ha sintomi lievi o nulli, eppure continua a diffondere il virus.
Il team di Gladstone, UC Berkeley e UCSF nel nuovo studio pubblicato nella rivista scientifica Cell, ha delineato la tecnologia per un test basato su CRISPR per il coronavirus Covid-19 che utilizza una fotocamera per smartphone per fornire risultati accurati in meno di 30 minuti.
Melanie Ott, virologa tedesca, ricercatrice presso l’Istituto di virologia e immunologia di Gladstone, tra i responsabili dello studio, ha detto:
«È stato un compito urgente per la comunità scientifica non solo aumentare i test, ma anche fornire nuove opzioni di test. Il test che abbiamo sviluppato potrebbe fornire test rapidi e a basso costo per aiutare a controllare la diffusione del coronavirus Covid-19».
La tecnica è stata progettata in collaborazione con Daniel Fletcher, bioingegnere della UC Berkeley, e Jennifer Doudna, ricercatrice presso Gladstone, professoressa presso l’UC Berkeley, presidente dell’Innovative Genomics Institute, e investigatrice dell’Howard Hughes Medical Institute. Jennifer Doudna insieme a Emmanuelle Charpentier recentemente ha vinto il Premio Nobel per la Chimica 2020 per aver scoperto l’editing del genoma CRISPR-Cas, la tecnologia alla base di questo lavoro.
Il loro nuovo test diagnostico in un dato campione non solo può generare un risultato positivo o negativo, ma misura anche la carica virale (o la concentrazione di SARS-CoV-2, il virus che causa il coronavirus Covid-19).
Daniel Fletcher è anche un ricercatore finanziato dal Chan Zuckerberg Biohub, ha detto:
«Se associata a test ripetuti, la misurazione della carica virale potrebbe aiutare a determinare se un’infezione sta aumentando o diminuendo. Il monitoraggio del decorso dell’infezione di un paziente potrebbe aiutare gli operatori sanitari a stimare lo stadio dell’infezione e prevedere, in tempo reale, quanto tempo sarà probabilmente necessario per il recupero».
Test più semplice grazie al rilevamento diretto
Gli attuali test coronavirus Covid-19 utilizzano un metodo chiamato PCR quantitativa, il gold standard dei test. Il real-time PCR, o PCR quantitativa, è una tecnologia utilizzata per quantificare gli acidi nucleici attraverso la misurazione della fluorescenza emessa da un fluoroforo, questa tecnica associa amplificazione e quantificazione in un’unica reazione.
La fluorescenza in una reazione di real-time PCR, aumenta in proporzione all’accumulo dei prodotti di PCR. Tuttavia, uno dei problemi con l’utilizzo di questa tecnica per testare il virus SARS-CoV-2 è che richiede DNA. Il coronavirus è un virus a RNA, significa che per utilizzare il metodo PCR, il RNA virale deve prima essere convertito in DNA. Inoltre, questa tecnica si basa su una reazione chimica in due fasi, inclusa una fase di amplificazione per fornire abbastanza DNA da renderlo rilevabile.
I test attuali in genere richiedono personale qualificato, reagenti specializzati e ingombranti apparecchiature di laboratorio, ciò limita fortemente dove possono essere eseguiti i test e causa ritardi nella ricezione dei risultati.
Gli scienziati in alternativa alla PCR stanno sviluppando strategie di test basate sulla tecnologia di modifica genetica CRISPR, che eccelle nell’identificazione specifica del materiale genetico.
Tutti i sistemi diagnostici CRISPR fino ad oggi hanno richiesto che il RNA virale fosse convertito in DNA e amplificato prima di poter essere rilevato, aggiungendo tempo e complessità; al contrario, il nuovo metodo descritto in questo recente studio salta tutte le fasi di conversione e amplificazione, utilizzando CRISPR per rilevare direttamente il RNA virale.
Jennifer Doudna ha affermato:
«Uno dei motivi per cui siamo entusiasti della diagnostica basata su CRISPR è il potenziale per risultati rapidi e accurati al momento del bisogno, questo è particolarmente utile in luoghi con accesso limitato ai test, o quando sono necessari test frequenti e rapidi. Potrebbe eliminare molti dei colli di bottiglia che abbiamo visto con il coronavirus Covid-19».
Parinaz Fozouni, studentessa laureata dell’UCSF impegnata nel laboratorio di Melanie Ott a Gladstone, negli ultimi anni ha lavorato a un sistema di rilevamento del RNA per l’HIV. Lo scorso gennaio quando è diventato chiaro che il coronavirus Covid-19 stava diventando un problema più grande a livello globale, insieme ai suoi colleghi Sungmin Son e María Díaz de León Derby, hanno deciso di spostare la loro attenzione sul coronavirus Covid-19. Ha detto:
«Sapevamo che il test che stavamo sviluppando sarebbe stato logico per aiutare la crisi, consentendo test rapidi con risorse minime. Invece della nota proteina CRISPR chiamata Cas9, che riconosce e scinde il DNA, abbiamo usato la proteina Cas13, che scinde il RNA».
La proteina Cas13 nel nuovo test è combinata con una che diventa fluorescente quando è tagliata e quindi da un tampone nasale è miscelata con un campione del paziente. Il campione viene inserito in un dispositivo che si collega a uno smartphone. Il campione se contiene RNA da SARS-CoV-2, la proteina Cas13 verrà attivata e taglierà la molecola reporter, provocando l’emissione di un segnale fluorescente, quindi, la fotocamera dello smartphone, essenzialmente convertita in un microscopio, può rilevare la fluorescenza e segnalare che un tampone è risultato positivo al virus.
Melanie Ott ha affermato:
«Ciò che rende davvero unico questo test è che utilizza una reazione a una fase per testare direttamente il RNA virale, al contrario del processo in due fasi nei test PCR tradizionali. La chimica più semplice, abbinata alla fotocamera dello smartphone, riduce i tempi di rilevamento e non richiede complesse apparecchiature di laboratorio. Inoltre, consente al test di produrre misurazioni quantitative piuttosto che semplicemente un risultato positivo o negativo».
I ricercatori affermano anche che il loro test potrebbe essere adattato a una varietà di cellulari, rendendo la tecnologia facilmente accessibile.
Daniel Fletcher ha detto:
«Abbiamo scelto di utilizzare i cellulari come base per il nostro dispositivo di rilevamento poiché hanno interfacce utente intuitive e telecamere altamente sensibili che possiamo utilizzare per rilevare la fluorescenza. I cellulari sono anche prodotti in serie e convenienti, dimostrando che non sono necessari strumenti di laboratorio specializzati per questo test».
Risultati rapidi e precisi per limitare la pandemia
Gli scienziati quando hanno testato il loro dispositivo utilizzando campioni di pazienti, hanno confermato che poteva fornire un tempo di risposta molto rapido dei risultati per campioni con cariche virali clinicamente rilevanti. Il dispositivo, in effetti, in meno di 5 minuti ha rilevato con precisione una serie di campioni positivi, mentre per i campioni con una bassa carica virale, ha richiesto fino a 30 minuti per distinguerlo da un test negativo.
Melanie Ott ha aggiunto:
«Modelli recenti di virus SARS-CoV-2 suggeriscono che test frequenti con tempi di risposta rapidi sono ciò di cui abbiamo bisogno per superare l’attuale pandemia. Ci auguriamo che con un aumento dei test, possiamo evitare blocchi e proteggere le popolazioni più vulnerabili».
Il nuovo test basato su CRISPR non solo offre un’opzione promettente per test rapidi, ma utilizzando uno smartphone ed evitando la necessità di ingombranti apparecchiature di laboratorio, ha il potenziale per diventare portatile ed eventualmente essere reso disponibile per i test point-of-care (analisi medica svolta in prossimità del sito di cura ed assistenza del paziente) o anche a casa. E potrebbe anche essere ampliato per diagnosticare altri virus respiratori oltre al virus SARS-CoV-2.
Inoltre, l’elevata sensibilità delle fotocamere degli smartphone, insieme alla loro connettività, GPS e capacità di elaborazione dei dati, le hanno rese strumenti interessanti per la diagnosi delle malattie nelle regioni con scarse risorse.
Melanie Ott in conclusione ha detto
«Speriamo di sviluppare il nostro test in un dispositivo che possa caricare istantaneamente i risultati in sistemi basati sul cloud mantenendo la privacy del paziente, ciò sarebbe importante per la ricerca dei contatti e gli studi epidemiologici, questo tipo di test diagnostico basato su smartphone potrebbe svolgere un ruolo cruciale nel controllo delle pandemie attuali e future».
