La pandemia è tutt’altro che finita con la variante Delta che sta seminando il panico tra le popolazioni non vaccinate e i casi di Covid-19 in aumento in tutto il mondo. La stragrande maggioranza dei campioni dei pazienti deve ancora essere inviata a un laboratorio per l’elaborazione, nonostante lo sviluppo straordinariamente rapido dei test diagnostici SARS-CoV-2 nell’ultimo anno e mezzo. Il ritmo del monitoraggio dei casi di Covid-19 rallenta quando un campione deve essere testato per una specifica variante del virus, deve essere sequenziato geneticamente, il che richiede ancora più tempo e risorse.
Ora, i ricercatori del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dell’Università di Harvard, del Massachusetts Institute of Technology (MIT) e di diversi ospedali dell’area di Boston hanno creato un test diagnostico economico basato su Crispr, consente agli utenti di testarsi per il SARS-CoV-2 e più varianti del virus utilizzando a casa un campione della loro saliva, senza bisogno di strumenti aggiuntivi.
Il dispositivo diagnostico, chiamato Sherlock minimamente strumentato (miSherlock), è descritto in un articolo pubblicato nella rivista Science Advances. È facile da usare, entro un’ora fornisce i risultati che possono essere letti e verificati da un’app in dotazione per smartphone. Ha distinto con successo tre diverse varianti di SARS-CoV-2 negli esperimenti e può essere rapidamente riconfigurato per rilevare varianti aggiuntive come Delta. Il dispositivo può essere assemblato utilizzando una stampante 3D e componenti comunemente disponibili per circa 13 euro, e con il riutilizzo dell’hardware riduce il costo dei singoli test a 5,10 euro ciascuno.
Helena de Puig ricercatrice nel laboratorio di Jim Collins del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, ha detto:
«Il miSherlock elimina la necessità di trasportare i campioni dei pazienti in un luogo di analisi centralizzato, semplifica notevolmente le fasi di preparazione dei campioni, offrendo a pazienti e medici un quadro più rapido e accurato della salute individuale e della comunità, che è fondamentale durante una pandemia in evoluzione».
Rose Lee in qualità di istruttore di pediatria presso il Boston Children’s Hospital con specializzazione in malattie infettive ha lavorato in prima linea per la pandemia di Covid-19 per oltre un anno. Le sue esperienze nella clinica hanno fornito l’ispirazione per il progetto che alla fine sarebbe diventato miSherlock, ha detto:
«Le cose semplici che erano onnipresenti in ospedale, come i tamponi nasofaringei, erano improvvisamente difficili da ottenere, quindi le normali procedure di elaborazione dei campioni sono state interrotte, un grande problema in un contesto di pandemia. La motivazione del nostro team per questo progetto era eliminare questi colli di bottiglia e fornire una diagnostica accurata per il coronavirus Covid-19 con meno dipendenza dalle catene di approvvigionamento globali, potendo anche rilevare con precisione le varianti che stavano iniziando a emergere».
Il team di ricercatori per il rilevamento SARS-CoV-2 si è rivolto a una tecnologia basata su Crispr (creata nel laboratorio di Jim Collins) chiamata “Sblocco del reporter enzimatico specifico ad alta sensibilità” (Sherlock), utilizza le “forbici molecolari” di Crispr per tagliare Dna o Rna in punti specifici, con un ulteriore vantaggio: questo tipo specifico di forbici taglia anche altri pezzi di Dna nell’area circostante, consentendo di ingegnerizzarlo con molecole di sonda di acido nucleico per produrre un segnale che indica che il bersaglio è stato tagliato con successo.
I ricercatori hanno creato una reazione Sherlock progettata per tagliare il Rna SARS-CoV-2 in una regione specifica di un gene chiamato nucleoproteina che è conservata in più varianti del virus, quando le forbici molecolari, un enzima chiamato Cas12a, si lega e taglia con successo il gene della nucleoproteina, vengono tagliate anche le sonde di Dna a singolo filamento, producendo un segnale fluorescente. Hanno anche creato ulteriori test Sherlock progettati per colpire un pannello di mutazioni virali nelle sequenze proteiche Spike che rappresentano tre varianti genetiche SARS-CoV-2: Alfa, Beta e Gamma.
Il team con il test in grado di rilevare in modo affidabile il Rna virale all’interno dell’intervallo di concentrazione accettato per i test diagnostici autorizzati dalla FDA (Organismo federale USA per il controllo degli alimenti e dei farmaci), ha poi concentrato i propri sforzi sulla risoluzione di quella che è probabilmente la sfida più difficile nella diagnostica: la preparazione del campione.
Sputa, aspetta, scansiona
Xiao Tan del team di ricercatori del dispositivo salivare, Istruttore di Medicina in Gastroenterologia presso il Massachusetts General Hospital, ha detto:
«Quando si esegue il test di un campione per gli acidi nucleici come il Dna o il Rna, ci sono molti passaggi che è necessario eseguire per preparare il campione in modo da poter effettivamente estrarre e amplificare quegli acidi nucleici. È necessario proteggere il campione mentre è in transito verso la struttura del test e assicurati anche che non sia infettivo se hai a che fare con una malattia trasmissibile; per rendere questo test diagnostico veramente facile da usare, era importante per noi semplificarlo il più possibile».
Il team ha scelto di utilizzare la saliva anziché i campioni di tampone nasofaringeo come metodo di raccolta, perché è più facile per gli utenti raccogliere la saliva, e gli studi hanno dimostrato che SARS-CoV-2 è rilevabile nella saliva per un numero maggiore di giorni dopo l’infezione, ma la saliva non trattata presenta delle sfide: contiene enzimi che degradano varie molecole, producendo un alto tasso di falsi positivi.
I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnica per risolvere questo problema, in primo luogo, hanno aggiunto alla saliva due sostanze chimiche chiamate DTT e EGTA e hanno riscaldato il campione a 95° C per 3 minuti, eliminando il segnale di falso positivo dalla saliva non trattata e aprendo eventuali particelle virali. Hanno quindi incorporato una membrana porosa progettata per intrappolare il Rna sulla sua superficie, che potrebbe infine essere aggiunta direttamente alla reazione Sherlock per generare un risultato.
Il team di ricercatori per integrare la preparazione del campione di saliva e la reazione Sherlock in un’unica diagnostica, ha progettato un semplice dispositivo alimentato a batteria con due camere: una camera di preparazione del campione riscaldata e una camera di reazione non riscaldata. L’utente sputa nella camera di preparazione del campione, aspetta dai tre ai sei minuti che la saliva penetri nel filtro. L’utente rimuove il filtro e lo trasferisce alla colonna della camera di reazione, quindi spinge uno stantuffo che deposita il filtro nella camera e perfora un serbatoio d’acqua per attivare la reazione Sherlock.
L’utente dopo 55 minuti guarda attraverso la finestra colorata del transilluminatore nella camera, la reazione è confermata dalla presenza di un segnale fluorescente. È possibile utilizzare anche un’app per smartphone in dotazione che analizza i pixel registrati dallo smartphone (vedi video).
I ricercatori hanno testato il loro dispositivo diagnostico utilizzando campioni clinici di saliva di 27 pazienti Covid-19 e 21 pazienti sani, hanno scoperto che il miSherlock il 96% delle volte ha identificato correttamente i pazienti positivi al Covid-19 e i pazienti senza la malattia il 95% delle volte. Hanno anche testato le sue prestazioni contro le varianti Alpha, Beta e Gamma SARS-CoV-2 aggiungendo alla saliva umana sana Rna virale sintetico a tutta lunghezza contenente mutazioni che rappresentano ciascuna variante, hanno scoperto che il dispositivo era efficace su una vasta gamma di Rna virale.
Devora Najjar, assistente di ricerca al MIT Media Lab e al Collins Lab, ha detto:
«Una delle grandi cose di miSherlock è che è completamente modulare. Il dispositivo stesso è separato dai test, quindi puoi collegare diversi test per la sequenza specifica di Rna o Dna che stai cercando di rilevare. Il dispositivo costa circa 13 dollari, ma la produzione di massa ridurrebbe l’alloggiamento a circa 2,55 euro. I test per nuovi obiettivi possono essere creati in circa due settimane, consentendo il rapido sviluppo di test per nuove varianti di Covid-19 e altre malattie».
Pronto per il mondo reale
Il team di miSherlock ha creato il proprio dispositivo pensando a impostazioni a bassa risorsa, poiché la pandemia ha portato alla luce le vaste disuguaglianze nell’accesso all’assistenza sanitaria che esistono tra le diverse parti del mondo. L’hardware del dispositivo può essere costruito da chiunque abbia accesso a una stampante 3D, i file e i progetti dei circuiti sono tutti pubblicamente disponibili online. L’aggiunta di un’app per smartphone è stata mirata anche ad ambienti con risorse limitate, poiché il servizio di telefonia mobile è disponibile praticamente ovunque nel mondo, anche in aree difficili da raggiungere a piedi. Il team di ricercatori è desideroso di lavorare con produttori interessati a produrre il miSherlock su larga scala per la distribuzione globale.
Jim Collins ha detto:
«Quando è iniziato il progetto miSherlock, non c’era quasi nessun monitoraggio della variante SARS-CoV-2. Sapevamo che il monitoraggio delle varianti sarebbe stato importante quando si valutavano gli effetti a lungo termine del coronavirus Covid-19 sulle comunità locali e globali, quindi ci siamo impegnati a creare una piattaforma diagnostica veramente decentralizzata, flessibile e di facile utilizzo. Risolvendo il problema della preparazione del campione, ci siamo assicurati che questo dispositivo fosse virtualmente pronto per l’uso da parte dei consumatori così com’è, siamo entusiasti di lavorare con partner industriali per renderlo disponibile in commercio».
Donald E. Ingber biologo cellulare e bioingegnere americano. È il direttore fondatore del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering presso l’Harvard University, ha detto:
«Combinando biotecnologie all’avanguardia con materiali a basso costo, questo team ha creato un potente dispositivo diagnostico che può essere prodotto e utilizzato a livello locale da persone senza titoli di studio avanzati in medicina. È un perfetto esempio della missione del Wyss Institute in azione quello di mettere le innovazioni che cambiano la vita nelle mani delle persone che ne hanno bisogno».
